Universidad Católica San Antonio de Murcia,UCAM, inicia estudio conjunto sobre los Caramelos Abedulce

Los investigadores José Eduardo Maté, Carlos Pérez-Albacete Martínez, del Grupo de Investigación en Odontología Clínica y Experimental liderado por José Luis Calvo Guirado, examinarán cómo interactúa este novedoso formato de Xilitol (azúcar de abedul) en caramelos con una composición del 100%, componente utilizado tradicionalmente como un edulcorante sin azúcar, en la salud bucodental de las personas.

Los expertos de la UCAM junto con la empresa malagueña, Abedulce, tratarán de conocer durante los tres meses que va a durar el estudio, si el Xilitol diseñado en cristales comestibles que permanecen más tiempo en la boca que cualquier aplicación anterior del compuesto, realmente aumentan la prevención de caries, y cuidado de la placa bacteriana dental en un porcentaje mayor a los tratamientos habituales.

Prof. Dr. Int. Dr. José Luis Calvo Guirado

Dr. Carlos Pérez Albacete Martínez

Dr. José Eduardo Maté Sánchez de Val

En dos fases divididas en experimentación el laboratorio (in vitro), y control de una población seleccionada. En primer lugar, estos investigadores de la UCAM analizarán el potencial bactericida, biodisponibilidad y la degradación del formato del xilitol; Y más tarde, en humanos, se testeará la saliva en un grupo de control representativo de cien personas, durante 3 meses, para examinar la modificación de la saliva, el contenido en bacterias y la respuesta de las mismas al uso posterior de los caramelos Abedulce.

Nota: El estudio esta actuamente en vigor y fue iniciado octubre 2017. Publicamos regularmente noticias, detalles y reultados de este estudio. A continuación se detalla el proyecto de estudio de la Universidad Católica San Antonio de Murcia - UCAM.

Titulo:

Valoración clínica y bacteriológica de los caramelos abedulce (100 % xylitol cristalizado). Estudio in vitro e in vivo.

1. Introducción:

La caries dental es un problema de salud pública en numerosos países desarrollados. Las estrategias de tratamiento se basan en la prevención enfocada a través de las modificaciones en la dieta y el uso de compuestos fluorados o selladores de fisuras dentarias.

El uso de agentes antibacterianos para limitar altos niveles de estreptococus mutans (EM) parece ser una modalidad prometedora de prevención de la caries. Los enjuagues con Chlorhexidina (CHX) han demostrado una capacidad para suprimir EM muy baja [9, 10]. Sin embargo, los estudios de tratamiento con CHX revelaron tanto la variabilidad en la respuesta de EM como la supresión total durante períodos prolongados [11, 12]. Uno de los principals problemas del uso mantenido de la CHx es la Resistencia que puede crear de otras especies concomitants, así como el desarrollo de otras patologías por agente externo. Sumado a ello, las tinciones son frecuentes a partir del 15-320 días de tratamiento con CHX.

Investigaciones recientes de la caries se han centrado en el Xylitol, que es un sustituto calórico del azúcar [13, 14]. La mayoría de las bacterias de placa carecen de la capacidad de fermentar el xilitol en productos finales cariogénicos. En su lugar, el xilitol se acumula intracelularmente en el EM como metabolito no metabolizable, inhibiendo así el crecimiento bacteriano, reduciendo su número y reduciendo la cantidad de placa.
La presencia de xilitol en el medio ambiente oral también selecciona a las poblaciones de EM menos virulentas, denominadas EM resistente al xilitol [13-17]. Por otro lado, se ha demostrado que la goma de mascar que contiene sorbitol reduce el riesgo de desarrollar caries.

Sin embargo, el sorbitol no tiene ningún efecto sobre el EM y por lo tanto se ha es menos efectivo que el chicle que contiene xilitol en la prevención de la caries dental [16, 18-20].
Streptococcus mutans es un coco Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil, catalasa negativo, productor rápido de ácido láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en, aproximadamente, 24 horas. Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina con la producción de ácido. Normalmente no desamina la arginina para producir amoniaco. Usualmente no producen ni hemólisis ni decoloración en agar sangre, es principalmente alfa o gamma hemolítico en agar sangre de cordero, aunque se han reportado unas pocas cepas hemolíticas. Streptococcus mutans se ha subclasificado en varios tipos con base en las propiedades inmunológicas, biológicas y genéticas: los serotipos de Streptococcus mutans son c, e, f y k. El hábitat natural de S. mutans es la boca humana.
En cavidad oral, las colonias se adhieren muy cerca de la superficie del diente e igualmente se puede recuperar en lesiones cariosas. Puede aislarse frecuentemente de heces en humanos y ratas. Aunque S. mutans no se distribuye ampliamente en animales salvajes, se ha aislado en monos, murciélagos, ratas salvajes habitantes de campos de cultivo de caña de azúcar y de monos Rhesus. Igualmente, se ha aislado en ratas y hámsteres de experimentación.

La hipótesis principal de este proyecto de investigación es que el uso de xylitol en una concentración pura y en forma de cristales durante un período de 5 - 7 minutos y con intervalos de 3 veces al día tras la higiene habitual ayuda a la prevención de la caries dental a través del control de la población cariogénica de EM.

2. Objetivos:

2.1: Estudio in vitro:
a. Analizar el potencial bacteriostático-bactericida del Xilitol en la presentación comercial.
b. Analizar la biodisponibilidad del xylitol en la presentación comercial.
c. Analizar la degradación del formato de presentación.
2.2: Estudio en humanos:
a. Análisis de la modificación saliva por medio de los caramelos con xylitol.
b. Análisis del contenido bacteriológico basal en pacientes con diferentes situaciones clínicas.
c. Analizar la respuesta bacteriológica posterior al uso de los caramelos de xylitol.

3. Material y métodos:
a. Estudio in vitro:

• Análisis de la degradación del caramelo en saliva artificial.

• Composición por 500 ml : Potasio cloruro 0,6 g- Potasio dihidrógeno fosfato 0,17 g- sodio cloruro 0,42 g- calcio cloruro 0,148 g- magnesio cloruro 0,025 g.-carboximetilcelulosa 5 g- sorbitol 15 g- agua purificada c.s.p.500 ml.
• Cálculo de volúmenes por medio de micro CT: precio y posterior al tiempo de trabajo en saliva artificial: 1 minuto, 3 minutos, 5 minutos, 7 minutos, 10 minutos.
• Comprobación del efecto bacteriostático-bactericida en medio de cultivo estándar para EM. Cultivo de EM:

El cultivo en agar es considerado como el estándar de oro ya que permite realizar recuentos bacterianos para establecer proporciones relativas, mediante métodos cuantitativos en medios no selectivos. Actualmente hay 5 medios de cultivo diferentes para el aislamiento de Streptococcus mutans. Estos son: Agar Mitis salivarius con bacitracina (MSB), Agar Mitis Salivarius con bacitracina y kanamicina (MSKB) Agar glucosa-sacarosa-telurito bacitracina (GSTB) Agar Tripticasa de soya con sacarosa y bacitracina (TYS20B) y Agar triptona extracto de levadura cisteína con sacarosa y bacitracina (TYCSB). El agar MS es el medio más ampliamente usado para aislar S. mutans y otras especies orales de estreptococos. El agar MS ha sido modificado para ser más selectivo en el aislamiento de S. mutans adicionando tanto sulfonamida (Agar MC), bacitracina (Agar MSB), polimixina o aun sacarosa (MS40S). Los métodos de recuento de colonias permiten determinar el grado de colonización producida por Streptococcus mutans según las edades, siendo de gran utilidad para identificar la población de alto riesgo de caries dentales y su aplicación permitiría desarrollar programas de prevención en salud oral en poblaciones específicas y vulnerables.

• Análisis de la biodisponibilidad (tiempo/efecto del xilitol): Por medio de cuenteo bacteriológico en diferentes tiempos de estudio: 1,3,5,7,10 minutos.

Pruebas diagnósticas para el aislamiento, conteo y tipificación de Streptococcus mutans
Existen diversos métodos y técnicas para el estudio y la identificación de patógenos asociados con caries y enfermedad periodontal los cuales incluyen: desde microscopía, cultivos, inmunología, hasta los más modernos como son las técnicas moleculares.

Microscopía directa
Puede proporcionar datos útiles como la morfología tradicional que nos permite clasificarlos como estreptococos Gram positivos. Por otro lado, la microscopía electrónica permite estudiar la estructura, distribución y cambios comparativos de los microrganismos en la placa. La desventaja de la microscopía es que sólo es posible establecer morfotipos y no géneros ni especies bacterianas.

Inmunoensayos
Entre las ventajas de los inmunoensayos para la detección de S. mutans están su sensibilidad, sencillez y rapidez, sin embargo, como desventajas de estos procedimientos se tiene que la especificidad puede dificultarse si hay reactivos que se cruzan con especies no incluidas en la batería (Phadebact Streptococcus) o con bacterias no cultivables.

Pruebas con Técnicas Moleculares
Con el nombre de Diagnóstico Molecular se engloba una serie de técnicas basadas en el análisis del DNA o ácido desoxirribonucleico. Gracias a la ingeniería genética, dicho análisis puede tener dos objetivos: la detección de microorganismos de forma rápida y eficaz, así como el estudio de variaciones en los genes humanos que pueden condicionar la aparición de enfermedades. Estas técnicas moleculares sirven para estudios epidemiológicos, a nivel general para determinación algunas enterotoxinas, identificación de genes de resistencia, identificación de especies difíciles de cultivar o no cultivables, clonación de secuencias de genes, entre otros.

Los primeros estudios a nivel molecular partieron del conocimiento de 18 cepas estreptocócicas cariogénicas identificadas como miembros de Streptococcus mutans las cuales fueron comparadas por medio de pruebas bioquímicas, deshidrogenasas, la composición de las bases del DNA y las homologías de la secuencia del DNA. Se encontraron ligeras diferencias bioquímicas (tales como la fermentación de carbohidratos) que se correlacionaron con grandes diferencias en la composición del DNA y la secuencia heterológica que existe entre estas cepas. De ahí que todas las cepas pudieron asignarse a uno de los cuatro grupos con base en las diferencias bioquímicas y genéticas. Más aun, estos cuatro grupos se correlacionaron con los cuatro grupos serológicos descritos en estudios previos.
Hace algunos años los métodos microbiológicos y bioquímicos disponibles no permitían la rápida detección e identificación de Streptococcus mutans y sobrinus. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar su presencia en saliva es una de las alternativas para su identificación rápida y segura. Inicialmente se realizó un recuento de estreptococos del grupo mutans en saliva por método microbiológico y luego la diferenciación de especies por la técnica de PCR.
Los resultados mostraron que la sensibilidad de la técnica de PCR fue superior a la del método microbiológico. Además, el análisis de la especificidad de la amplificación, evaluada por restricción enzimática, confirmó la presencia de estas bacterias. Con base en determinadas secuencias se han desarrollado ensayos de PCR que pueden diferenciar los estreptococos del grupo mutans de otros estreptococos pertenecientes al grupo viridans.

Las mayores limitaciones de los métodos de cultivo incluyen la detección de Streptococcus mutans en las muestras clínicas, una morfología inconsistente dependiendo del medio de cultivo usado, su alto costo y la dedicación que requiere. Más aun, el cultivo requiere de muestras viables haciendo que su aplicación en estudios epidemiológicos y de desempeño en investigación sea impráctica. Se han desarrollado algunos iniciadores (primers) y sondas (probes) de DNA ya que los metodos de cultivo convencionales pueden limitar los estudios de población y su interacción con otras bacterias en la cavidad oral. 

Muchos de ellos se enfocaron en los genes específicos asociados con la virulencia de Streptococcus mutans, tales como glucosiltranferasas, fructosiltransferasas, dextranasa y proteína fijadora de glucanos B, el sistema de fosfotransferasa de la sacarosa dependiente del fosfoenolpiruvato y el antígeno proteínico. De igual forma se diseñaron otros primers para amplificar regiones específicas de regiones de los genes del rRNA 16S del S. mutans. Se ha encontrado que muchos primers para PCR funcionan bien para cultivos puros de Streptococcus mutans. Sin embargo, hay poca información de si las regiones blanco para PCR pueden estar, también, presentes en otras especies bacterianas encontradas en el mismo hábitat de S. mutans o de si estos primers se pueden encontrar en muestras clínicas mezcladas. Claro que algunos de esto sitios genéticos podrían no ser únicos para S. mutans.

Varios de estos métodos son sistemas de detección bacteriana basados en PCR, muchos de los cuales son análisis cualitativos y, en consecuencia, no adecuados para la evaluación apropiada de la susceptibilidad a la caries o de la actividad cariosa. El análisis cuantitativo es esencial para el monitoreo del número de células y/o de la relación de bacterias cariogénicas en muestras orales tales como la placa dental y la saliva. Más aun, el monitoreo del número de bacterias cariogénicas en biopelículas orales se requiere desde la perspectiva de la investigación de la biopelícula. Con la prueba de PCR en tiempo real se han desarrollado sistemas para la detección de copias de DNA lo que ha permitido la rápida detección y absoluta y relativa cuantificación de bacterias cariogénicas humanas incluyendo S. mutans y S. sobrinus de muestras orales. 

b. Estudio en humanos:

Tamaño muestral necesario: 100 pacientes.

• Test salival basal y estimulada:

Determinar el ph Salival:

El método de Ericsson
Es el método clásico normal para determinar la capacidad buffer de la saliva.
Ud. necesita:

• HCl
  • para el método de saliva no estimulada se utiliza HCl 0.0033 mol por litro
  • para el método de saliva estimulada se utiliza HCl 0.005 mol por litro
• 2-octanol
• Un tubo
• Un embudo
• Un cronometro
• Un aparato electrónico (pH-meter)

¿Cómo lo hace?
1. Colecte saliva, por el método de la saliva estimulada o no estimulada, descripta en Prueba de Secreción Salival
2. Si la saliva reunida es mixta, debe realizarlo dos veces
3. 1.0 ml de la saliva se transfiere a 3.0 ml HCl (0.0033 mol por l para la saliva no estimulateda, 0.005 mol por l para la saliva estimulada)
4. Para prevenir el espumando, agregue una gota de 2-octanol
5. Mezclar durante 20 minutos para quitar CO2
6. por último el pH en la saliva se evalúa por medio del aparato electrónico (pH-meter)

DETERMINACIÓN DE LA SALIVA NO ESTIMULADA
La determinación de saliva no estimulada tiene mucha importancia ya que está relacionada con el tiempo de aclaramiento de azúcar y ácidos de la boca.
La recogida de saliva no estimulada o en reposo se realiza con el paciente sentado en posición relajada, con los codos apoyados en las rodillas. Se debe evitar cualquier movimiento de las mejillas o de la mandíbula; la lengua se apoya en las superficies linguales de los incisivos superiores. En esta posición, el paciente dobla la cabeza hacia delante y va dejando gotear la saliva pasivamente sin tratar de escupir ni masticar.
La saliva se recoge en un tubo graduado durante 5 minutos. Los resultados se expresan en ml/min, existiendo amplias variaciones entre las personas.
TASA DE SECRECIÓN NORMAL........................................: 0.25-0.35ml/min TASA DE SECRECIÓN BAJA ................................................ : 0.1-0.25ml/min

DETERMINACIÓN DE SALIVA ESTIMULADA
Esta tasa es más práctica y, por lo tanto, es a menudo realizada en la clínica. El paciente debe masticar una cápsula de parafina estéril de aproximadamente 1 gr. (se empleará parafina con un punto de fusión de 42-44°C), e ir recogiendo toda la saliva que segregue en un tubo graduado durante 5 minutos. Es preferible desechar la saliva producida en los 2 primeros minutos y empezar a contar a partir de ese momento; de esta forma se arrastran restos residuales que queden en boca. Se puede reducir la formación de espuma introduciendo el tubo graduado en un recipiente con hielo o añadiendo una gota de octanol.
El resultado se expresa en ml/min y, al igual que ocurre con la saliva no estimulada, la tasa es muy variable entre diferentes personas.
TASA DE SECRECIÓN NORMAL.......................................: >1ml/min. TASA DE SECRECIÓN BAJA.......................................... : <0.7ml/min.

• RECUENTOS SALIVARES DE ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO MUTANS

Se describe a continuación el CRT® bacteria).
CRT® BACTERIA PARA LB y SM (Vivadent, Schaan, Liechtenstein)
Este sistema consta de una lengüeta de plástico recubierta por ambos lados por medios selectivos y conectada a un tapón de rosca el cual cierra un tubo transparente, quedando el dispositivo seguro para su almacenamiento e incubación, conservándose estéril y húmedo. Una de las superficies de la lengüeta está cubierta por agar Rogosa, para recuentos de LB (color verde) y en la otra cara con agar Mitis Salivarius Bacitracina para recuentos de SM (color azul oscuro). El kit también incorpora cápsulas de parafina, tabletas de NaHCO3 y etiquetas de identificación. La dinámica de utilización es la siguiente:
1. Se recoge saliva estimulada como ya se ha visto anteriormente.
2. Desenroscar el tapón, y extraer el porta agar del interior del tubo.
3. Se coloca una tableta de NaHCO3 en la base del tubo.
4. Retirar con cuidado las láminas protectoras de ambas superficies de agar, teniendo cuidado de no tocar el mismo.
5. Se vuelca la saliva con cuidado sobre las dos superficies del agar con ayuda de una pipeta, sin arañar las mismas y de forma que queden humedecidas. En esta operación se mantiene la lengüeta en posición vertical y se deja gotear la saliva sobrante.
6. Eliminar las últimas gotas de saliva dejando escurrir un ángulo del borde inferior de la lengüeta con el agar sobre papel absorbente limpio y enroscar el tapón y cerrarlo bien.
7. Se identifica el tubo con una etiqueta adhesiva y se incuba a 36±1oC durante 48 horas en posición vertical.

Interpretación:
La lectura de los resultados se realiza comparando la densidad de crecimiento de colonias de Lactobacillus y de estreptococos del grupo mutans de las lengüetas con una tabla de densidad ya establecida. La colonias de Lactobacillus son blanquecinas o transparentes y las de estreptococos del grupo mutans son de color azul oscuro casi negras.
Los resultados se interpretan como unidades formadoras de colonias/ml de saliva (ufc/ml). La lectura de la prueba es más fácil si se examina bajo luz reflejada. Debemos comparar densidad de crecimiento y no el área de las colonias ya que nos podemos encontrar pocas colonias pero muy grandes.
RECUENTO ALTO....... >100 000 ufc/ml saliva
RECUENTO BAJO....... <100 000 ufc/ml saliva

Los recuentos altos de Lactobacillus indican un número elevado de caries abiertas o de obturaciones desbordantes. Si se procede a tapar las lesiones y los valores se mantienen elevados, indica elevada frecuencia de ingestión de hidratos de carbono.
Esta contraindicado realizarlos durante tratamientos con antibióticos (esperar al menos 14 días), y si se utilizan colutorios antimicrobíanos se debe esperar 12 horas. Al desecharlos no se debe olvidar que son cultivos microbianos que deben ser manejados con cuidado.